¿Qué toma de muestras y prueba de diagnóstico podemos solicitar para la detección del vPPA?

MV. Mg. Mercy Gisela Ramírez Velásquez

Docente de la sección de Virología del Laboratorio de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la UNMSM

I. Toma de muestras para la detección del vPPA

Para una adecuada colección de muestras es importante tener en cuenta el objetivo del diagnóstico, si es para vigilancia activa (en productos o subproductos del cerdo, en monitoreo de granjas porcinas) o para vigilancia pasiva (notificación de brotes o con sospecha de vPPA). Teniendo claro los objetivos, debemos de tener en consideración estos dos aspectos relevantes del virus de la peste porcina africana (vPPA); el primero, que el virus puede mantenerse mucho tiempo infectivo en materia orgánica, secreciones y excreciones del cerdo, así como en sus productos y subproductos (Davies et al., 2015; Beltrán-Alcrudo et al., 2017); y el segundo, que el daño o lesión que ocasiona en los tejidos dependerá de la virulencia de la cepa del vPPA. A continuación, veremos las muestras que deberán ser remitidas en cada caso:

1. Toma de muestra para el diagnóstico serológico

Existen dos tipos de muestras que pueden remitirse al Laboratorio, una es el suero sanguíneo, obtenido mediante la colección de sangre en tubos al vacío sin ningún aditivo o anticoagulante y la otra muestra, los fluidos orales, que a diferencia de la primera permiten evaluar en una sola muestra el comportamiento poblacional de cerdos en una granja (Mur et al., 2013). El objetivo es determinar anticuerpos contra el vPPA mediante pruebas de laboratorio como ELISAS o pruebas de inmunofluorescencia indirecta.

2. Toma de muestra para el diagnóstico inmunohistoquímico.

Para este caso, deberá tener en consideración realizar la necropsia en un ambiente apropiado y respetando los protocolos de bioseguridad establecidos en cada país o región. Los tejidos más representativos para los casos agudos y subagudos son el bazo, los nódulos linfáticos, riñón y los pulmones (Sánchez- Vizcaino et al, 2019). El objetivo es la detección de antígenos- proteínas virales del vPPA mediante ELISA de captura o inmunofluorescencia directa.

3. Toma de muestra para el diagnóstico molecular

Si el objetivo es el diagnóstico del vPPA en casos sospechosos de la enfermedad puede tomarse muestras de sangre y/o tejidos. Es importante mencionar que la sangre constituye la fuente biológica con mayor carga viral, es así que una gota de sangre (200µl) puede contener 3 millones de copias de vPPA (Blome et al., 2013). Por esta razón, al ser menos invasivo es ideal para el diagnóstico molecular. La muestra de sangre entera deberá ser colectada en tubos al vacío con EDTA como anticoagulante, ya que la heparina puede inhibir la reacción de PCR. Asimismo, los tejidos y los fluidos orales también pueden ser utilizados para su diagnóstico. Otro tipo de muestra que puede ser utilizada como parte de la vigilancia activa son los productos o subproductos del cerdo como las salchichas o jamones que provienen de países como China donde hay casos del vPPA. Para este caso se enviarán los paquetes sellados directamente al laboratorio para su análisis y procesamiento.

II.- Pruebas de diagnóstico disponibles para vPPA

Es importante mencionar que todo caso sospechoso de PPA deberá ser confirmado mediante pruebas de diagnóstico autorizadas por el Servicio Sanitario oficial del país y bajo las normas establecidas en el Manual terrestre (capitulo 3.8.1) de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). A continuación, describiremos las pruebas de diagnóstico más empleadas y utilizadas como herramientas de vigilancia en países donde no hay reportes de la enfermedad:

2. 1 Inmunofluorescencia directa (IFD)

Esta prueba se utiliza de forma adicional para detectar antígeno del vPPA en muestras de tejidos de animales sospechosos. Una prueba positiva a IFD en animales con signos clínicos sugerentes a la enfermedad más lesiones compatibles proporcionan un diagnóstico provisional de PPA que debe ser confirmado con pruebas de aislamiento viral- hemadsorción y/o pruebas moleculares. Esta prueba utiliza anticuerpos anti-PPA marcados con el fluoróforo isotiocianato de fluoresceína (FITC). Si la muestra es positiva al vPPA se observará fluorescencia en el citoplasma de las células infectadas por el virus. La lectura se realiza en un microscopio de inmunofluorescencia (OIE, 2019). Esta prueba no es recomendable en muestras autolisadas o en estado de putrefacción y tampoco es recomendable en etapas crónicas de la enfermedad porque disminuye la sensibilidad de la prueba al producirse grandes cantidades de complejos inmunes.

2.3 ELISA directo o de detección de antígeno

Es una técnica alternativa, pero su sensibilidad es muy inferior a la prueba de PCR, no debe utilizarse como método único para la detección del virus y los resultados deben confirmarse con una PCR o una prueba de hemoadsorción (HAD) en cultivo celular. Existe un kit comercial para su uso con muestras de sangre, bazo o ganglios linfáticos porcinos, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Gallardo et al., 2019). Este kit consiste en un ELISA tipo sándwich de doble anticuerpo. La placa está recubierta por un anticuerpo monoclonal (MAb) específico de la proteína de la cápside del virus que se une al vPPA en las muestras positivas. Tras el lavado, se añade un segundo MAb específico de un epítopo distinto de la proteína de la cápside y conjugado con peroxidasa. La unión de este segundo anticuerpo al antígeno capturado se detecta al añadir el sustrato apropiado (OIE, 2019).

2.4 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Es la prueba más utilizada por su alta sensibilidad y especificidad, así como por la amplia gama de muestras que pueden utilizarse como fluidos orales, sangre, tejidos frescos, tejidos en estado de putrefacción, salchichas, jamones y embutidos, principalmente (Gallardo et al., 2019).  El principio de esta técnica es la amplificación de genes conservados de todas las cepas del vPPA utilizando cebadores y enzimas durante su desarrollo. Es muy útil para identificar cepas no HAD y de baja virulencia. Actualmente existen dos variantes del PCR muy utilizadas para el diagnóstico del vPPA: el tiempo real y el PCR convencional. Ambos protocolos se encuentran disponibles en el manual terrestre de la OIE. Asimismo, existen kits de diagnóstico molecular disponibles de forma comercial. Su implementación dependerá de las recomendaciones y pautas establecidas por las entidades sanitarias del país.

2.5 ELISA indirecto o de detección de anticuerpos

Las pruebas serológicas son las pruebas de diagnóstico más utilizadas debido a su simplicidad, bajo costo y empleo de quipos no muy sofisticados. En países donde no exista la enfermedad, su uso es pertinente ya que no existen hasta la fecha vacunas comerciales disponibles, por lo que resultados positivos a anticuerpos contra el vPPA indican exposición a virus de campo. Además, los anticuerpos anti-vPPA aparecen poco después de la infección (7–10 días) y persisten durante varios meses o incluso años (Sánchez- Vizcaino, 2019). Por lo general, los cerdos infectados por cepas virulentas de vPPA mueren antes de que aparezca una respuesta inmunitaria humoral específica. No existen anticuerpos totalmente neutralizantes. Debe mencionarse que cuando los cerdos se infectan con cepas avirulentas o de baja virulencia del vPPA, las pruebas serológicas pueden ser el único modo de detectar a los animales infectados (OIE, 2019). Para el diagnóstico serológico existen diversos kits disponibles comercialmente que son estandarizados y validados para trabajar con diferentes tipos de muestras como suero, plasma y fluidos orales (Mur et al., 2013). La recomendación es comunicarse con el laboratorio y preguntar sobre el tipo de muestra que debe enviarse dependiendo del kit que tenga disponible el Laboratorio.

Referencia Bibliográfica

1. Beltrán-Alcrudo D, Arias M, Gallardo C, Kramer S, Penrith M.  2017. African swine fever: detection and diagnosis – A manual for veterinarians. FAO Animal Production and Health Manual No. 19. Rome. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). 88 pages.
2. Blome S, Gabriel C, Beer M. 2013. Pathogenesis of African swine fever in domestic pigs and European wild boar. Virus Research 173 (1). https://doi.org/10.1016/j.virusres.2012.10.026.
3. Davies K, Goatley L, Guinat C, Netherton C, Gubbins S, Dixon L, and Reis A. 2015.  Survival of African Swine Fever Virus in Excretions from Pigs Experimentally Infected with the Georgia 2007/1 isolate. Transbound Emerg Dis doi:10.1111/tbed.12381
4. Gallardo C, Fernández-Pinero J, Arias M. 2019. African swine fever (ASF) diagnosis, an essential tool in the epidemiological investigation. Vir Research 271. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2019.197676.
5. Mur L, Gallardo C, Soler A, Zimmermman J, Pelayo V, Nieto R, Sánchez-Vizcaíno J, Arias M, 2013. Potential use of oral fluid samples for serological diagnosis of African swine fever. Vet Microbio, 165 (1-2). https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2012.12.034.
6. OIE (Organización Mundial de Sanidad Animal).2019. Manual terrestre de la OIE. Disponible en: https://www.oie.int/es/enfermedad/peste-porcina-africana/
7. Sanchez-Vizcaino JM, Laddomada A, Arias M. 2019. African swine fever. In: Zimmerman JJ, Karriker LA, Ramírez A, Schwartz KJ, Stevenson GW, Zhang J, editors. Diseases of swine. 11th ed. Ames, Iowa. Wiley-Blackwell. p. 443-452.

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