Producción de anticuerpos en lechones inmunizados con una cepa recombinante atenuada de Salmonella enteritidis que expresa proteína de cápside del PCV2

Autores: Manolo Fernández Sánchez, Manuel Albetis Apolaya
Laboratorio Farmacológicos Veterinarios S.A.C. (FARVET)

Introducción

El Circovirus Porcino Tipo 2 (PCV2) es un patógeno porcino económicamente importante y, aunque pequeño, tiene la tasa de evolución más alta entre los virus de ADN (Franzo, G. et al.,  2016). Desde el descubrimiento de PCV2 a fines de la década de 1990, este virus minimalista con un genoma de ADN monocatenario de 1,7 kb y dos genes indispensables se ha convertido en uno de los patógenos porcinos más importantes y actualmente está sujeto al mayor volumen de intervención profiláctica en forma de vacunas en la producción porcina mundial. Actualmente, PCV2 se puede dividir en cinco genotipos diferentes, PCV2a a PCV2e (Xiao C.-T. et al., 2015). En el año 2006 se introdujeron vacunas comerciales para PCV2 en una población porcina mayoritariamente infectada por PCV2b. Desde 2012, el genotipo PCV2d ha reemplazado esencialmente al genotipo PCV2b predominante anteriormente en América del Norte y también se documentan tendencias similares en otras regiones geográficas como China y Corea del Sur (Kwon T et al., 2017). Este es el segundo gran cambio de genotipo de PCV2 desde el descubrimiento del virus. El aumento potencial de la virulencia del genotipo PCV2 emergente y la eficacia de las vacunas actuales derivadas del genotipo PCV2a contra los virus del genotipo PCV2d han recibido una atención considerable

Proteína ORF2 del PCV2.

  1. La estructura tridimensional de PCV2 fue visualizada por software PyMOL. Una proteína sw la cápside (CP) y el epítopo señuelo inmunodominante CP 169-180 están marcados en verde y rojo, respectivamente (Wei. 2019).
  2. La región ORF2, difiere ligeramente entre PCV-1 y PCV-2. Esta variación dentro de PCV puede explicar por qué PCV-1 no es patógeno, mientras que el PCV-2 es patógeno.
  3. Esta es la región inmunogénica del virus y es el área principal de la investigación en la creación de una vacuna para el tratamiento de PMWS.

Región ORF2 del PCV2, región inmunogénica del virus

Signos clínicos del PCV2

Síndrome de desmedro multisistémico posdestete (PMWS)

Síndrome porcino de dermatitis y nefropatías

Camada de una cerda infectada experimentalmente con PCV2

Clonación y expresión de una proteína en una bacteria vectorizada

La estrategia que se emplea consiste en colocar un fragmento de ADN portador del gen en cuestión dentro de una molécula de ADN extracromosómico autorreplicante (por ejemplo un plásmido bacteriano), acompañado de genes que permitan la selección de las moléculas híbridas, en el interior de una bacteria, que puede multiplicarse a gran velocidad formando un clon (grupo de células con los mismos genes) y permitir que la maquinaria de la bacteria transcriba y traduzca el segmento de ADN que le hemos introducido.

Pasos para la Clonación de ADN:

  1. Cortar y pegar el ADN

Abrir el plásmido y «pegar» el gen dentro. Este proceso depende de enzimas de restricción (que cortan el ADN) y de ADN ligasa (que une el ADN).

  • Transformación y selección bacteriana

El ADN producido en la ligación (que puede ser una mezcla de plásmidos deseados, plásmidos de productos secundarios y fragmentos de ADN lineal), se agrega a las bacterias. Las bacterias se someten a un golpe de calor, que mejora la eficacia con la que el ADN entra durante la transformación. Sin embargo, solo una pequeña minoría de las bacterias incorporará con éxito un plásmido.

Panel de la izquierda: diagrama de un plásmido que contiene un gen de resistencia a antibióticos

  1. Producción de proteínas

La colonia elegida crece en un cultivo grande (en un matraz de 1 litro, por ejemplo). Se induce la expresión del gen contenido en el plásmido en las bacterias de ese cultivo, con lo que el gen blanco se transcribe en ARNm y el ARNm se traduce en proteína. La proteína codificada por el gen se acumula dentro de las bacterias.

Desarrollo de una vacuna Salmonella Vectorizada (Salvac-Circo) contra PCV2

PCV2 posee un genoma de ADN de cadena simple de 1.7 kb que codifica alrededor de 3 proteínas, siendo la proteína de cápside (cap) la más inmunogénica. Actualmente, las vacunas comerciales disponibles contra PCV2 pueden no prevenir la replicación del virus o tienen un periodo de protección limitada.

 Durante los últimos años se ha estudiado el uso de Salmonella como vector vacunal por su capacidad de estimular una respuesta inmune innata y adaptativa, esto debido a la presencia de flagelinas y lipopolisacáridos.

Previamente, nuestro grupo desarrolló una cepa de Salmonella enteritidis atenuada mediante ingeniería genética, denominada SE3934-Cap. En el presente trabajo se insertó el antígeno cap de PCV2 en SE3934 y se evaluó su capacidad para estimular la respuesta humoral en lechones.

Objetivos que se cumplieron con la investigación

Se generó una cepa vectorizada de Salmonella enteritidis que expresa la proteína de Cápside (cap) de PCV2 y evaluar su capacidad de estimular la respuesta inmune humoral en lechones.

Se detectó una banda de aproximadamente 55 KDa por Western blot correspondiente a la fusión del antígeno Cap con la proteína Clya.

Detección del antígeno Cap de PCV en SE3934-Cap. La inmunodetección se llevó a cabo mediante el uso de un anticuerpo anti 6xHis. Carril 1: Cepa SE9394 parental; Carril 2: Cepa SE3934-Cap.

Detección una banda de aproximadamente 55 KDa por Western blot correspondiente a la fusión del antígeno cap con la proteína Clya.

Conclusión

La proteína cap fue correctamente expresada por SE3934-Cap, mostrando un peso molecular de aproximadamente 55 KDa por western blot. Sin embargo, un monitoreo de la persistencia y de la expresión del gen heterólogo in vivo es necesario para determinar el grado de efectividad de la presentación del antígeno.

El uso de Salmonella enteritidis como vector nos permitió realizar ensayos de vacunación oral.

La inmunización con SE3934-Cap mostró una estimulación de la respuesta humoral contra PCV2 a partir de los 7 días hasta los 51 días post-inmunización.

Se observó un aumento en los parámetros de producción (ganancia de peso) en el grupo de lechones inmunizados con SE3934-Cap.

La cepa SE3934-Cap presenta un potencial para ser usada como vacuna vectorizada contra PCV2.

 En este proyecto se ha utilizado la cepa Salmonella Enteritidis 3934 (3934Vac) como vehículo para la expresión del  antígeno heterólogo CAP de la cápside del circovirus PCV2 (Porcine Circovirus Type 2).

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